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Western Blot 常见问题分析(二)

发布时间:2020/6/2 15:21:41      阅读次数:930

 

Western Blot是实验室中常见且重要的一种分子生物学实验方法,通常我们在日常交流中说的就是简称“WB”,中文名称是“蛋白印迹”或“免疫印迹”,其核心本质是抗原抗体的特异性反应,通常用来判断特定蛋白在样本中是否表达及粗略分析特定蛋白表达量的高低.


在上周文章“Western Blot 常见问题分析”,我们讲到了Western Blot实验结果中常见的条带弱 条带弯曲弥散三种现象,这次我们再来讲讲蛋白提取时需注意的地方及结果条带杂带多 背景脏等常见问题.

 

<  蛋 白 提 取  >

 

以裂解组织样本提取蛋白为例,操作步骤简易如下:

组织剪成小块 按一定比例加入裂解液 匀浆 充分裂解后离心取上清用于后续实验


当我们用RIPA裂解液时,常会发现裂解产物中有一小团透明的胶状物质.不用担心,这是正常现象,这团胶状物是含有基因组DNA等的复合物.如果检测的蛋白不是和基因组结合特别紧密的,可以直接离心后取上清用于后续实验,当然也可以超声打散再离心取上清.

在提取蛋白时,我们需注意:

1. 尽可能采用简单方法进行样品处理,避免蛋白丢失;

2. 根据蛋白定位选择合适的裂解缓冲液,并加入合适的蛋白酶抑制剂,避免蛋白降解,从而保证检测的准确性;

3. 低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解,所有离心机需提前预冷,所有操作在冰上完成;

4. 样品裂解液应新鲜制备,并且分装冻存于-80℃,切勿反复冻融已经制备好的样品.
 

<  常 见 问 题 之 杂 带 多  >

 

原因分析1:曝光时间太长;
解决方案1:缩短曝光时间;
原因分析2:抗体 抗原浓度高;
解决方案2:降低抗体 抗原浓度,建议用含5%脱脂奶粉的TBST稀释二抗;
原因分析3:交叉反应性,抗体质量问题;
解决方案3:选择单克隆抗体,选择高品质的抗体.

 

<  常 见 问 题 之 背 景 脏  >

 

原因分析1:缓冲液污染;
解决方案1:使用新配制的缓冲液,缓冲液最好现用现配;
原因分析2:封闭不完全,封闭液选择有误;
解决方案2延长封闭时间,推荐正常血清做封闭液;
原因分析3:膜污染,漂洗不完全;
解决方案3:更换新膜,操作中戴手套,用镊子夹膜,避免直接接触膜;增加漂洗时间和缓冲液体积;


BSA 血清脱脂奶粉作为封闭液区别:

BSA是最常用的封闭液,成分单一适用于大多数情况,不可用于偶联BSA的免疫原的封闭.


血清的封闭主要有两方面,一方面是封闭待测样本某些物质与蛋白非特异性的结合,从而降低背景,从这点看,血清和BSA没有明显区别.另一方面是待测样品中可能会有Fc受体,Fc受体与抗体的结合与特异性无关,而封闭血清中有抗体可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间的结合,BSA无法封闭Fc受体.


脱脂奶粉的成分相对复杂,较BSA和血清应用要少一些.脱脂奶粉中含有少量的生物素和碱性磷酸酶残留,在使用生物素-亲和素系统和碱性磷酸酶标记的二抗时,会造成高背景或本底水平增高.


<  常 见 问 题 之 分 子 量 错 误  >

原因分析1:分子量偏大,可能蛋白发生糖基化 甲基化修饰,融合了标签蛋白;
解决方案1:查找文献看下是否蛋白发生修饰,将融合的标签蛋白分子量与目的蛋白分子量相加,为正确的分子量.

原因分析2:分子量偏小,可能存在不同的剪接体或者目的蛋白被降解;
解决方案2:查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种不同的编码mRNA,确保蛋白样本未被污染,确保含有蛋白酶抑制剂.
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