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Western Blot 常见问题分析(三)

发布时间:2020/6/2 15:41:05      阅读次数:1580

前两周的“Western Blot 常见问题分析”中,我们主要分享了一些异常的实验结果,今天我们来讲讲关于Western Blot实验可能会存在的疑惑.话不多说,直接上货:


1.Western实验中,用TBS还是PBS?

选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性很重要.PBS的缓冲能力强于TBS,TBS在pH7.0以下缓冲能力较弱.一般根据实验目的选用合适的缓冲液,如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析,阳离子缓冲液选TBS;阳离子交换层析时,阴离子缓冲液选PBS.Western blot中使用PBS和TBS均可,根据需要选择合适的浓度.


2. 没有注明可以用来做Western blot的一抗,可以用来做Western blot吗?

不一定,因为有的抗体是识别线性表位的,有的是识别构象型表位,识别构象型表位的抗体不能用于Western blot,因为在Western blot中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原,而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏.


3.做Western每次只加一种一抗,可以同时加两种或者多种一抗吗?

不要同时加两种一抗,因为如果结果里面有非特异性信号的话,就说不清楚.做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照,也是先上目的蛋白的一抗 二抗 ECL显色 压片 洗片,漂洗后加内对照的一抗 二抗 ECL显色 压片,洗片.


4. Western用的一抗,单抗好些还是多抗好些?

做Western来讲,理论上单抗比多抗的特异性要好但价格偏高,一般来说多抗就OK了.用于Western的抗体和用于ELISA的抗体,一般来说用于Western的抗体识别的是氨基酸序列特异性,而可用于ELISA的抗体要看抗原种类,有些是识别氨基酸序列特异性,有些是识别构象特异性,所以一般根据说明书来确定.做免疫印迹选择抗体主要考虑两个问题,一是所选抗体是否识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白,另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带.


5. 半干转是否要取膜 滤纸 胶同样大小,因为胶大小不一定规则,膜和滤纸会大一点,那样会不会短路?

可以相等,但是如果滤纸 膜比凝胶大就比较容易形成短路了,上下两层滤纸也不能因过大而相互接触,这样会短路,电流不会通过胶和滤纸.转移前和转移过程中看看电压就行,正常的半干转是慢慢变高的,结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的.


6. 不能很好的将大分子量蛋白转移到膜上,转移效率低怎么解决?

大分子量蛋白倾向于在胶里沉淀,阻碍转移.可以考虑:在转膜缓冲液里加入终浓度0.1%的SDS有助于增加转移效率;转移缓冲液中加入20%甲醇,甲醇可以降低蛋白质洗脱效率,增加蛋白质和NC膜的结合能力,防止凝胶变形,延长大分子量蛋白转移时间;用4℃湿转过夜代替半干法转膜.


 
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