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ELISA试验常见问题
A1、ELISA试验出现非常弱的结果，常见有7种原因，其解决方法如下：1)可能原因：温育的时间或者温度不够；解决方法：校正温育箱温度。2)可能原因：显色反应时间太短；解决方法：校正定时钟准确定时。3)可能原因：所用配制缓冲液的蒸馏水有问题；解决方法：使用新鲜合格的蒸馏水。4)可能原因：加入抗体/酶的稀释液浓度太低；解决方法：按照说明书保存试剂盒和准确配制工作液。校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密。5)可能原因：酶标仪滤光片不正确；解决方法：检查酶标仪使用的滤光片。6)可能原因：试剂盒没有充分平衡；解决方法：试剂室温平衡至少120分钟，确保所有试剂已平衡至室温。7)可能原因：不正确的试剂储存方式；解决方法：按照说明书要求保存试剂盒。2、试验结果白板，而且阳性对照不显色，应如何分析和查找原因?答：试验结果白板，而且阳性对照不显色，常见原因如下：a)可能原因：漏加或者误加试剂；解决方法：检查试验记录和剩余试剂。每次加液前均应核对标签。b)可能原因：试剂过期；解决方法：使用有效期内的产品。c)可能原因：洗板液配制中出现问题，如量筒不干净含HRP酶抑制物(叠氮钠等);解决方法：使用干净的器皿，正确配制试剂。d)可能原因：温育的时间或温度不够；解决方法：校正温育箱温度。e)可能原因：标准品失活或者丢失；解决方法：标准品正确保存、溶解和混匀。f)可能原因：抗体失活或者丢失；解决方法：更换抗体或者提高抗体浓度。g)可能原因：酶失活或者丢失检查方法：把工作浓度的酶再稀释20-100倍，取5uL加入100ul的显色液A和B混合底物，终止后显色是否能达到1.0左右，此为酶的粗略估计。解决方法：更换酶或者提高酶的浓度。h)可能原因：显色底物失活检查方法：加少量的工作浓度的酶，TMB是否很快显色。解决办法：更换显色底物。3、试验结果空白背景高，这是什么原因造成的?答：试验结果空白背景高，常见原因如下：a)可能原因：洗板不干净；解决方法：充分洗涤，彻底拍干；洗板要防止交叉污染；浓缩洗液准确配制；吸嘴尽可能一次性使用；加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。b)可能原因：显色液变质或者试剂过期；解决方法：检查试剂盒有效期。c)可能原因：蒸馏水受酶等污染；解决方法：使用新鲜蒸馏水；d)可能原因：试剂混用；解决方法：不同批号试剂勿混用。e)可能原因：培养箱温度超过37℃或反应
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做ELISA实验需要注意哪些问题?
A1、ELISA操作前准备工作试剂盒的选择ELISA操作前，应做好实验的设计、选择适合自己检测范围和灵敏度的试剂盒、提前订购和准备试剂及耗材、处理样本等准备工作。样本处理在收集标本前需有一个完整的计划，需要清楚要检测的成份是否足够稳定。ELISA检测提倡新鲜标本尽早检测，对收集后当天就进行检测的标本，及时储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，请取材后，将标本及时分装后放在-20℃或-80℃条件下保存。因冰室与室温存在一定温差，蛋白极易降解，直接影响实验质量，所以避免反复冻融。2、ELISA标准品稀释标准品严禁反复冻融。标准品的倍比稀释应事先做好准备，如离心管的准备和编号以及稀释液的准备；稀释时，应充分混匀；采用进口或者硅化的EP管，减少蛋白吸附。在实验孔内进行倍比稀释时，注意操作规范，枪头勿刮划预包被的孔底。注意：睿信品牌试剂盒标准品是已倍比稀释好的，是即用型标准品。3、ELISA操作中的洗涤洗涤是ELISA实验中是最多次数的操作，也是非常重要的步骤。不严格的洗涤容易出现洗不干净或交叉污染现象，实验重复效果差的现象。不管用多道加样器、洗瓶、吸管，还是洗板机，严格按照说明书操作不要减少步骤洗涤的洗涤体积、洗涤时间和洗涤次数。注意标准化操作将减少实验误差和不同实验之间的误差。操作者常出现洗板不干净现象，请比照“手工洗板小贴士”操作：a)洗液不要溢出孔外，以免污染相邻的孔，特别是每次洗板的前两遍，若高浓度的孔污染了低浓度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定会增高。b)特别注意：设计实验的时候要考虑实验孔的位置，保证甩掉洗液时，空白孔、低浓度孔或阴性对照组在上面或一侧或分开最好。同时注意甩掉洗液的动作翻转(从正上方旋转120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右摇摆、旋转来甩液体!甩出后以直线方式补2-3次甩出液体。c)用干净的滤纸，不要用卫生纸，因为细小粉尘或者碎屑容易吸附到孔底，导致洗板不干净，结果偏高或偏低，重复孔的数值也会相差很大。d)每次拍板不要重复在一个地方拍，特别是洗去酶的步骤；拍板不宜过轻，否则拍不干净，拍板很用力不会对蛋白有什么影响。但注意不要太重，以至把板条给拍断。每次洗板后轻叩几下，最后一次一定要扣干净。e)不能减少洗液体积、洗板时间和次数。洗板时间太短，洗板效果不佳。延长洗板时间和增加洗板次数可以使
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ELISA实验步骤
A1、固相载体选择聚苯乙烯：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯：聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。2、包被①板孔的选择：ELISA级别的微孔板；②抗体选择：选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓度；③包被缓冲液：pH7.2磷酸盐缓冲液；④包被温度：2-8℃过夜包被或室温(37℃)包被2h;⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化。一般包被浓度为1ug/ml-2ug/ml3、封闭①包被之后一定要立即封闭(封闭非特异性抗体);②选择效果较好的封闭剂(细胞培养级BSA、Tween等)。4、加样及孵育①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡；②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm,转速在500±50rpm;③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示；④洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性；⑤封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。5、显色和终止①使用前需检查，底物在加入96孔板之前应为无色透明；②显色底物需现配现用，避免污染；③孵育时间，说明书上为参考范围，具体需要根据实验条件自行摸索。可参考标曲浓度最大孔的颜色，变为蓝色较明显时即可。
