发布时间：2025/10/23 14:45:54 阅读次数：27
实验细节决定成败
在实验室里,你可能已经遇到过这种情况：同样的样本,这次测定为阳性,下次却变成了阴性,结果完全颠倒！问题出在哪里？很多时候,这并非试剂盒的问题,而是隐藏在实验操作细节中的魔鬼——比如加样顺序和边缘效应.
在ELISA实验中,加样这一基础步骤却是最容易出错的环节之一.
加样太快会导致微量加样的准确性和均一性无法保证.而如果加在孔壁上部的非包被区,则易导致非特异吸附.更可怕的是,溅出会对邻近孔产生污染,气泡则会使反应液界面产生差异.
有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性,下次测定为阴性,往往就是上述加样及试剂的错误所致.
那么,如何保证加样的质量呢？
加样不可太快,要避免加在孔壁上部,不可溅出和产生气泡.实验样本过多时,可分批次操作,以减少实验时间延长造成的误差.最重要的是,要做到一份样本一个移液头,防止交叉污染.
在使用96孔板的ELISA测定中,你是否常发现有“边缘效应”——即外周孔显色较中心孔深的现象？
经研究证实,在温育中的热力学梯度可能是根本原因.聚苯乙烯本身为不良热导体,在实验室的常规ELISA测定中,将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱时,在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度.
那么如何排除这一干扰呢？
使用水浴是在温育时排除"边缘效应"的有效方法.或者在将反应溶液加入至板孔中时,将板和溶液均加热至温育温度（如37℃）,就可以很容易地排除“边缘效应”,并且可提高测定的重复性.
温育是ELISA测定最为关键 最容易出现问题的步骤.目前的常规ELISA测定中,将板从室温置于37℃温箱,板升温时,在孔间可能会产生热力学梯度.
温育的实际时间与温度控制至关重要.加完样本和（或）试剂后将微孔板从室温放入水浴箱或温箱中时,孔内温度从室温升至37℃需要一定时间,如果将微孔板一放入温箱即开始计时,容易造成实际测定中温育时间不够,可能导致弱阳性标本测不出来.
建议如有两种温度,尽量使用较低的温育温度 较长反应时间的条件；也可以用一个小温度计放置在板孔反应液中测量观察.
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ELISA实验的成败往往隐藏在加样顺序 边缘效应控制 温育条件等细节中.严谨的实验操作习惯结合优质可靠的试剂盒,才能保证实验结果的准确性和可重复性.
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